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四环冻干机—心脏瓣膜的冻干

更新时间:2023-08-10 点击次数:442


心脏瓣膜的冻


ALAIN C进行了心脏瓣膜的冻干研究。ALAIN提出瓣膜冻干应具备三项功能:第一,应该能够提供多孔结构,以便当使用瓣膜将其悬在介质中复水时,能允许纤维原细胞迅速进入瓣膜内部;第二,杀死异源细胞;第三,保持胶原质结构以保证瓣膜的机械强度。ALAIN的实验研究中用的是猪的瓣膜,来自屠宰场。猪的平均年龄和重量分别是18周和80kg。心脏瓣膜是在猪死后2h以内从心脏上切下来的,瓣膜片在磷酸盐缓冲液里洗涤三次。叶片在4℃下存储超过24h。实验中总共用到了76个叶片。



心脏瓣膜玻璃化温度的测定

将质量为20~30mg的一块瓣膜叶片密封在铝制器皿中,使用装配有液氮低温附件的Perkin-Elmer DSC2仪器测量。以1.25K/min的速度冷却到173K,在以40K/min的加热速度过程中,记录温度,得到温度-热流图如图5-22所示。由图中数据得出,玻璃化转变温度Tg-83℃。

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冻干工艺对冻干心脏瓣膜形状的影响:

心脏瓣膜的冻干实验是在一种实验型快速冻干仪器中进行的,其结构如图5-23所示。 

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将冷阱浸在硅树脂油的冷浴中冷却到-70℃,用旋片泵维持真空度,用麦氏计来测量真空度,可以达到0.005mmHg。

三个瓣膜叶片用一种单纤维尼龙丝系在一小块PVC塑料网上,装在一个Falcon塑料管中。大多数实验中,Falcon塑料管浸在液氨或控制了温度的硅树脂油中,瓣膜叶片在冷空气环境下冷冻。冷却Falcon塑料管的冷浴的温度为-15℃、-40℃、-80℃或者-196℃。然后,将Falcon塑料管从低温液体中取出,快速地放入冻干机的冻干箱里;少数实验中瓣膜叶片被直接浸入-60℃或者-80℃的酒精浴冷冻。样品的冻结速率数据列于表5-13中。在叶片角落里粘有一个与图表记录器相连接0.12mm的铜镍合金,用于测量温度。冻干室初始温度为室温22℃,然后通过浸在-20℃或-30℃的恒温浴里控制温度。之后,自然升温,此为非控制冻干。

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真空干燥连续进行3h,这时叶片温度稳定在室温(22℃)。通过SEM对这些叶片的部分进行检查显示出预期的多孔结构,如图5-24所示。孔是由冷冻中形成和干燥中驱除的冰晶体产生的。而且有一个规律,冷却速度越低孔越大[对比图5-24(a)和(b)],但不连续,每个样品也不一样[如图5-24(b)的例子]。叶片的厚度与冷却速度有直接联系。因为大多数孔的尺寸显得比预期的要小得多,可以尝试着在干燥前对叶片熔化和再冷冻,这样可以提高冰孔的尺寸。其他更多的叶片以6℃/min的速度冷却,在温度为37℃的水浴里熔化,然后以相同的速度再冷冻,三个以上再以72℃/min的速度冷却,但是它们产生了与仅仅经过一次冷冻的叶片相似的SEM外形。

另一个问题就是稠密层的出现,许多样品表面很显然没有孔[见图5-24(b)];SEM图片显示叶片表面是压实的,内部孔和外部很少连通[见图5-24(c)];在叶片物质内部同样出现了紧凑层[见图5-24(d)]。这些现象显示了在干燥过程中发生了广泛的坍塌,可能是在干燥过程中温升较快造成的。在处理结束,叶片的含水量很少,很可能是发生了熔化和蒸发,而不是升华。因此后面进行了严格的控制冷冻干燥实验。

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在控制冷冻干燥过程中,选择了两种冷冻方法:将Falcon试管放在-40℃的冷浴里(平均冷却速度为6.7℃/min),或者是放在196℃的液氮里(平均冷却速度为51℃/min)。将干燥烧瓶放在设定温度的冷浴里6h,它的温度就被控制在-20℃或-30℃;6h后关掉冷藏室,让浴温自动上升。测量的温升速度是0.06~0.08℃/min,从-20℃达到0℃需要5h,从-30℃到达0℃需要6.3h。总的真空干燥时间需要16h,最终温度为5~11℃。每个实验方案冻干了三个叶片,然后经过SEM检验。从8个瓣膜里得到的24个叶片都经过相同的处理,在干燥处理过程中或结束后和再水化后测量水的含量。结果显示在-30℃时的干燥速度是很慢的,20℃时尽管在那个阶段的最后将干燥时间从6h延长到12h可以保证水的含量很低,但是它对最后剩余水气没有影响。更多的研究是在为-20℃或-30℃温度下干燥6h的初始干燥后,再以0.06℃/min的加热速度进行第二次干燥,整个过程需要16h。

SEM照片(见图5-25)显示,-20℃干燥的叶片有更好的外观,多孔基体更统一,没有坍塌的区域和厚的、稠密的边界层。孔的尺度比非控制冷冻干燥的叶片看上去大很多[比较图5-24(a)和图5-24(b)与图5-25(a)和图5-25(b)]。冻结速率为7℃/min的叶片孔显得比50℃/min的叶片的孔稍大而且更均匀。-30℃干燥的叶片表面外壳更厚一些,显示了在第二个干燥阶段中已经发生了坍塌。这是由于在最初的温度为-30℃干燥6h后,有更高的水含量。所以,起初干燥的温度最好是-20℃。但是,在两种情况下,表面都缺乏明显的与内部多孔基体相连通的孔。

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为了确定从SEM检查得到的压痕数量,测量了冻干叶片的厚度和孔的尺寸。图5-26显示了对两种冷却速度的数据比较,一种是非控制快速干燥,另一种是-20℃的控制干燥。不考虑干燥方法的影响,快速冷冻后叶片变得更厚了;同样,不考虑冷却速度的影响,控制干燥的叶片也更厚了。假如避免了崩塌,对于两种冷却速度,沿着垂线方向从内流到外流表面的冰孔数量相似。对分别经过1℃/min、5℃/min、25℃/min冷却速度的冷冻,然后进行初始干燥温度为-20℃的冷冻干燥的叶片,通过SEM测量了其孔的截面积的分布。在两个垂直方向上进行了表面观察,第一个是半径方向,即从容器表面指向容器中心;第二个所指的切线方向与第一个方向成90°,即它与容器表面的切线平

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行。结果如图5-27所示。可以看出冷却速度(1℃/min)低,冻干样品冰孔尺度分布广,而且在断面的两个方向上没有显著的差别;冷却速度快则冻干样品冰孔尺度分布窄,而且切线方向上比半径方向上孔径更大,也就是说,冰晶体形成于切线方向。经测量,在两种冷却速度下,大多数冰孔半径方向上面积为100~350μm2,但是冷却速度为5℃/min的比25℃/min孔径稍长,样本的横断面积分别为400μm2和200μm2。冻干工艺为:以5℃/min的冷却速度,然后在-20℃真空干燥6h,接着在缓慢的加热过程中进行二次干燥,得到的冻干多孔叶片残余水分为8%~9%,内部孔的测量尺寸为100~350μm2。这对横断面积为150-200μm2的纤维原细胞提供了足够的通道。因此,在后来的所有研究中都采用了上述叶片冻干工艺。

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SEM未能回答的问题:“内部冰孔与孔之间是互相连通,还是它们是独立封闭的?"为了回答这个问题,干燥前对叶片涂上荧光素,然后再用甲基安息香酸盐进行清洗后对它进行显微镜共焦扫描(CSM),结果显示它的结构与开放的塑料泡沫相似。不过,SEM和CSM都暗示内部的多孔结构很少与表面联通。图5-28(a)和(b)显示了SEM的外观,流入表面上的凹陷很小(10~20μm),显得与内部的多孔结构不连通。CSM同样揭示了表面的口袋状结构,尽管横向连通的可能性不能被全部排除,但是它们似乎是封闭。

然而,当叶片被放置在玻璃皿上,大部分流人表面朝上,用1根8×20号手术针就可以创造出三角形的穿孔,直径尺寸为75~100μm[见图5-28(c)和(d)],穿透了流出表面,孔径小于10μm。

ALAN的这项研究主要针对的是他提出的冻干瓣膜应具备的第一项功能:提供多孔结构,以便当使用瓣膜将其悬在介质中复水时,能允许纤维原细胞迅速进入瓣膜内部。

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