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四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术(七)

更新时间:2023-05-11 点击次数:406

5.3.2  大鼠皮肤吹干与冻干比较研究

10年后,西北大学的杨维也进行了大鼠皮肤的冷冻干燥实验。他首先重点研究了浓度、孵育时间、孵育温度对大鼠皮肤冻干保护剂海藻糖负载量的影响。实验结果表明,大鼠皮肤对海藻糖的载入量的优化条件为:海藻糖浓度800mmo1/L,孵育温度37℃,孵育时间为7h。之后,皮肤组织分别进行冻干和吹干。

(1)冻干  皮肤组织在37℃加载海藻糖,4℃加载DMSO,将负载了海藻糖和DMS0的皮肤块放入冻存管内,冻存管放入程序冻存盒,置于-80℃冰箱冷冻。12h后将冷冻的皮肤组织连同冻存管转入预冷的冻干机,去掉冻存管盖子。冷冻干燥机运行状态参数为:冷阱中温度-45℃,冷阱上方温度0℃左右,真空度10Pa,冻干时间设置30h。先将皮肤样品置于冷阱中冻干24h,然后在冷阱上方冻干6h。先在冷阱中冻干是为了防止皮肤组织中固态的水分回融再结晶对组织产生冰晶损伤,组织中大部分游离水升华后转冷阱上方冻干,此时温度稍高可以进一步除去组织内部水分。

(2)吹干  皮肤组织在37℃、800mmol/L海藻糖培养液中孵育7h加载海藻糖,负载了海藻糖的皮肤用滤纸拭去表面残留液体,表皮朝下平展于玻璃培养皿中,培养皿敞口置于生物安全柜(打开送风开关)吹干。大鼠皮肤的吹干时间设置为20~30h可以将皮肤中水分去除,玻璃化状态良好。

经检测得知,刚冻干皮肤活性比刚吹干皮肤活性高1/3,保存时间延长到28d,冻干组皮肤活性与刚吹干组相当。冻干过程中,皮肤组织内水分先在DMSO保护下逐渐冻结,放入冻干机后固态水升华,由于海藻糖取代水分子的作用,干燥过程组织形态结构和活性不会发生变化,但在吹干过程中皮肤组织内水分由液态直接蒸发,原来包绕在细胞外的水膜以及和蛋白质等生物大分子结合的水分子可能还未被海藻糖取代就已蒸发。上述原因可能导致未保存的冻干皮肤活性高于吹干皮肤。干燥保存的皮肤活性开始降低速率较快,降到一定程度后降低速率减慢,所以保存一周后冻干组和吹干组皮肤活性没有统计学差异。

干燥保存的皮肤置于饱和湿度的恒温培养箱37℃预水化15min后,皮肤依次用含800mmol/L和400mmol/L海藻糖的DMEM培养液室温下孵育15min,用不含海藻糖的无血清DMEM培养液漂洗3次以上,清除皮肤组织中残留的DMSO和海藻糖,最后转入无海藻糖的DMEM培养液中孵育2h,进行形态观察。如图5-10所示。

冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状。复水后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽。冻干皮肤角质层局部受损,而组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织没有差异。将冻干后复水的皮肤移植回自体大鼠,可存活13d。

自体移植后冻干组皮肤存活时间较吹干组长,可能是由于吹干过程对皮肤组织产生的损伤较大。冻干组皮肤在6d皮下出现血红色区域可能是自体动物在移植皮下发生血管化,但后来有两处变成暗红色,而其他区域血红色减弱消失可能是血管化失败,而吹干组未出现血红色,可能根本就没有发生血管化。

通过HE染色和透射电镜对比分析新鲜皮肤和干燥皮肤组织结构和细胞结构。HE染色结果显示干燥保存过程没有明显改变皮肤组织结构,也未影响皮肤组织的结构完整性。透射电镜结果说明干燥皮肤具有与新鲜皮肤无差别的细胞结构和胞外胶原结构,同时可观察到干燥皮肤细胞中结构正常的线粒体和平滑的核膜等细胞器。结构学观察结果证明干燥保存未对皮肤组织结构和细胞结构产生明显影响。

通过荧光标记和MTT活性分析研究干燥过程对皮肤活性影响。荧光标记结果表明,除毛囊处明显受损外冻干皮肤组织大部分区域在水化后能恢复活性。MTT活性分析结果显示冻干和吹干皮肤仍能分别保持58%和48%的活性。


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