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四环冻干机—生物制品和生物组织冻干技术(六)

更新时间:2023-04-27 点击次数:435

5.3

皮肤的冻干   

冻干皮肤在医学上的临床应用研究始于20世纪50年代。动物皮肤的冻干目的是用于对药物经皮肤渗透性的研究。由于透皮吸收给药新型的问世,药物经皮渗透性的研究正成为开发这类新型筛选药物的重要手段,由于大量长时间动物皮的需求,实际应用时常将待用皮放在冰箱里,可保存1周左右。时间再长,不但影响药理实验的稳定性,而且皮肤将变质。为增长皮肤保存期,可将动物皮肤冻干保存;人类皮肤冻干的目的是用于再植,为烧伤或外伤皮肤的病人植皮。

5.3.1 大鼠皮肤冻干工艺及药物渗透性实验

东北大学的郑文利博士早在20世纪末就进行了大鼠皮肤冻干的实验研究。取活大鼠脱颈处死后,立即用电动去毛刀去其腹部鼠毛,剥离皮肤,除去皮下脂肪层、血管及残留物,用蒸馏水冲洗干净,制成不同尺寸的皮片,再用生理盐水冲洗数次备用。将制备好的大鼠皮放在速率降温仪中,以-5℃/min、-l5℃/min、-30℃/min三种不同速率降温至-30℃。将三种不同降温速率预冻的大鼠皮,分别放入小型冻干机中抽真空,30min后压力稳定在120Pa,不主动加热,连续干燥34h后关机,充氮气后取出,用无菌塑料袋封装后,放在干燥器内保存。

将以不同预冻速率冻干的大鼠皮肤,经10%福尔马林固定,石蜡包埋制片,进行病理切片,切片厚度4~5μm,HE染色,再显微镜观察。新鲜大鼠皮组织切片如图5-8所示,以5℃/min速率预冻并冻干大鼠皮组织切片如图5-9所示。从图中可以看出冻干皮组织与新鲜皮组织相本相同,未见细胞破裂、上皮脱离、组织褶皱、细胞变性和细胞间隙增宽等异常,说明冻干皮组织结构未发生变化。其他速率预冻并冻干后的结果基本一致。

冻干大鼠皮角质细胞间隙脂流动性的电子自旋共振(ESR)测定:选  用5-噁唑氮氧自由基硬质酸(5-DSA)作为自旋转标记物,将新鲜的和  三种不同预冻速率的冻干大鼠皮角质层样品泡在浓度为1×10-4mol/L  的5-DSA缓冲液(pH=7.4)中12h,保温20℃,然后取出淋洗干净,37℃烘箱干燥1h,分别放进电子自旋共振波谱仪样品管内,再置于腔中。ESR测定条件:扫描宽度200G,接收增益3.2×104,时间常数20.48ms,微波功率5.02mW,扫描时间83.888s,调制频率  25.000kHz,调制幅度0.947G。经ESR波谱分析得知,三种不同冻  结速率预冻的冻干大鼠皮与新鲜大鼠皮各系数相比无显著差异,说明  冻干大鼠皮肤未引起表皮细胞间脂质结构的变化,大鼠表皮角质细胞  间脂质排列的有序性没有改变,流动性没有增加。

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实验采用尼莫地平为模型药物(一种脑血管扩张药),选用预冻速  率为l5℃/min的冻干大鼠皮和新鲜大鼠皮做药物渗透性实验,考察其  组织结构有无变化。实验采用装置为V-lia-chien水平扩散池。它是由  两个等容积的玻璃半池组成,半池内径为l.35cm,有效扩散面积为  1.43cm2,容积为10mL。半池上方开口为取样口,池底有凹陷平  台,起到固定搅拌的作用。实验时将皮肤固定在扩散池的两个半池之  间,角质层面向供体池。水化1h后,供体池加入10mL尼莫地平的  30%丙二醇水过饱和溶液,接受池中加入10mL的30%丙二醇水,置  于32℃温水浴中,磁力搅拌,定时取样并更换全部接收介质。样品经  徽孔滤膜(0.45nm)过滤,续滤液,样品进人高效液相测定。尼莫地平  外含量测定采用高效液相色谱法紫外检测。色谱条件:色谱柱  Spherisorb46mm×25cm,检测波长237nm,流动相是甲醇/水  (64/36),流速为1.1mL/min,进样量10μL。实验结果如表5-11所  示。

表5-11正常皮肤和冻干皮肤对尼莫地平渗透量比较


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表5-11中的数据表明,在渗透9、10h、12h时,冻干皮肤与正常皮肤对药物尼莫地的渗透量无显若性差异。可见,冻干的大鼠皮肤能够满足药理的实验要求,可用做透皮制的实验研究,可以长期贮存备用。



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